細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。現在我們就來講講如何正確的凍存細胞：

一、材料

（一）儀器 　　1. 凈化工作臺 　　2. 離心機 　　3. 恒溫水浴箱 　　4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃） 　　5. 倒置相差顯微鏡 　　6. 培養箱 　　7. 液氮冰箱

（二）玻璃器皿 　　1. 吸管（彎頭、直頭） 　　2. 培養瓶 　　3. 玻璃瓶（250ml、100ml） 　　4. 廢液缸

（三）塑料器皿 　　1. 吸頭 　　2. 槍頭 　　3. 膠塞 　　4. 移液管（10ml） 　　5. 15ml離心管 　　6. 凍存管（1～2ml）

（四）其他物品 　　1. 微量加樣槍 　　2. 紅血球計數板 　　3. 記號筆 　　4. 醫用橡皮膏 　　5. 移液槍

（五）試劑 　　1. D-Hanks液 　　2. 小牛血清 　　3. 培養液 　　4. 雙抗（青霉素、鏈霉素） 　　5. 胰蛋白酶（0.08%） 　　6. 1NHCl 　　7. 7.4%NaHCO3 　　8. DMSO（分析純）或無色新鮮甘油
二、操作步驟

（一）細胞凍存 

1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養液；

2. 取對數生長期的細胞，用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來，懸浮生長的細胞則直接將細胞移至15ml離心管中、；

3. 離心1000rpm，5min；

4. 去除胰蛋白酶及舊的培養液，加入適量配制好的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節凍存液中細胞的zui終密度為5×106/ml～1×107/ml；

5. 將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml；

6. 在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者；

7. 凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/ 　　min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中**，取出凍存管，移入液氮容器內。

（二） 細胞復蘇

1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。

2. 從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養液，混勻；

3. 離心， 1000rpm，5min；

4. 棄去上清液，加入含10%小牛血清培養液重懸細胞，計數，調整細胞密度，接種培養瓶，37℃培養箱靜置培養；

5. 次日更換一次培養液，繼續培養。

三、注意事項

1．從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養細胞都可以用于凍存，但為對數生長期細胞。在凍存前一天換一次培養液； 　　

2．將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護工作，以免凍傷； 　　

3．凍存和復蘇用新配制的培養液。